今天我们较为具体地聊一聊分离纯化中常用的“硅胶柱层析”。

一、什么是硅胶柱层析？

硅胶柱层析，也叫硅胶柱色谱法，是一种利用混合物中各组分在固定相（硅胶）与流动相（洗脱剂）之间的吸附能力差距，而达到分离主张的物理步骤。

单一打个譬喻：就如同“游泳角逐”，泳池赛路（色谱柱：填满了硅胶的层析柱）；活带头（混合物样品：各类分歧结构的化合物）；活带头的体能（流动相：不休向下贱动的洗脱剂）；水产生的阻力（固定相吸附力：硅胶对分子的吸附作用）。体能好、游泳技术高（即：吸附力弱的化合物与硅胶作用弱）游得快，先达终点；反之体能差、游泳技术通常（即：吸附力强的化合物与硅胶作用强）游得慢，后达终点。就这样，分歧的化合物就被分隔。

二、硅胶柱层析主题道理

基于吸附色谱，即利用混合物中各组分在两种不相混溶的相（固定相和流动相）之间分配平衡的差距，从而实现分离。通常极性大的化合物与硅胶的吸附作用强，不容易被洗脱下来，在柱中移动得慢；极性幼的化合物与硅胶吸附作用弱，容易被溶剂洗脱下来，移动得快。从而实现按极性从幼到大顺次被洗脱分离。

固定相：硅胶（SiO2·xH2O），它是一种多孔性物质，表表含有大量的硅羟基（-Si-OH），这些基团拥有极性，可能通过氢键、偶极-偶极相互作用、范德华力等吸附其他极性分子。

流动相：有机溶剂（通常长短极性或极性分歧的混合溶剂）。

通常极性幼的用乙酸乙酯-石油醚系统，极性较大的用甲醇-二氯甲烷系统；具体也能够凭据洗脱剂极性大。ㄒ韵旅姘ご蔚菰觯正己烷<石油醚<环己烷<甲苯<二氯甲烷<乙酸乙酯<丙酮<甲醇<水<乙酸，进行组合调整得到想要的极性流动相。

三、硅胶柱层析具体操作过程

1.拌样

通常拌样硅胶选用60-80目硅胶，样品与硅胶的比例节造在1:1~1:1.5，具体能够凭据样品的分离难杜纂样品在溶剂中的溶化度进行适当调整，确保样品能齐全吸附在硅胶上。

并不是所有样品都必要拌样，好比易挥发的挥发油，就能够直接上样，不用拌样。

2.造浆

凭据待分离样品的沉量，称取相应比例沉量的硅胶。通常用200-300目硅胶做填料，其用量是样品的5~50倍，当然也能够凭据分离主张与难度调整填料的用量。选择相宜的容器，首先装入硅胶体积约1倍量的装柱溶剂，再缓慢参与硅胶，用棒沿着一个方向充分的搅拌，使其硅胶齐全浸润在洗脱剂中，同时排除浆液中空气，并开释出浆液中的热量。若是样品中待分离化合物用洗脱剂展板，其指标黑点的Rf值是0.2，那么用装柱洗脱剂展板，其指标黑点的Rf值应≤0.1。当然也能够选择洗脱剂中极性幼的单一试剂做为装柱溶剂。

举例，若是洗脱剂是石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统，就用石油醚做为装柱溶剂，若是洗脱剂是二氯甲烷-醇系统，就用二氯甲烷做为装柱溶剂。另表需凭据样品TLC展板的情况，节造匀浆中的含水量，若是TLC发展剂中不能有水，必须预吓酌无水硫酸钠脱去洗脱剂中的水分，甚至还需对硅胶进行预先干燥处置。

3.装柱

通常选取湿法装柱，以便得到更好的分离成效。

具体操作如下：

将造好的匀浆液，一次性或急剧、陆续地倒入下端含有液位高约1~5cm装柱溶剂的色谱柱中。若柱层析管用的是无筛板玻璃柱，得用棉花将柱底塞紧（棉花肯定不能塞的过厚，以免后期影响洗脱的流快）。注入匀浆后，同时打开柱下端活塞，让装柱溶剂流出，硅胶颗粒则在沉力或压力下均匀沉降。同时对层析管进行敲打震荡，使其沉降均匀无气泡。若为中压色谱柱，则用泵将装柱溶剂不休的泵入柱内（常用柱能够用加液球或气压泵加压），直至下端流快恒定，通常柱内填料约被压缩至9/10的体积。该过程肯定要确保柱内的填料面不被扰动，维吃旖整。

4.上样

在填料界面上方预留肯定高度的装柱溶剂（液面高度通常取决于上样量的几多与填料界面上方的渣滓柱高，最佳液面高度为上完样后预留液体液面高度约0.5cm），慢慢将干燥好的硅胶拌样物参与柱内。待上完样后，在上样层界面上方参与一层3-5cm高度的60-80目硅胶，再放入一层脱脂棉，用沉物（干净的玻璃瓶盖、砂芯筛板等）压实，再慢慢参与一些装柱溶剂，使其齐全浸入试剂中后，即可急剧参与大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶界面的平坦。

5.洗脱与网络

柱层析要思考分子扩散效应与分离度之间的衡量（及节造流快和洗脱剂的强度）。首先往柱子里加足量洗脱剂，液面高度维持10cm以上，若为常压柱，可在柱顶盖个幼漏斗预防试剂挥发＝谠炝骺，通常2-3BV/h（太快了组分分不开，太慢了耗功夫），用下端活塞调节流快大幼＝谠煜赐鸭燎慷，洗脱强度太低会导致洗脱成效不好（即指标点用洗脱剂发展的Rf值过。，通常单一指标点选取其Rf值约0.2的洗脱剂进行洗脱，多个指标点选取梯度洗脱。洗脱液网络通常用TLC分析判断，每份网络量通常选取方式：杂质黑点段用大瓶网络，急剧通过；指标黑点段（即指标成分快出来时与指标成分快实现时）换用幼瓶密集网络，通常用试剂瓶，每瓶接200-500mL（凭据柱子大幼定），做好象征，并凭据TLC检测分析纯度。

四、当苦衷项与技巧总结

1.过柱前必须通过TLC摸索到相宜的发展剂系统，并确认分离成效，从而确定洗脱剂。

2.凭据TLC确定的洗脱系统，是否全程控水很关键：若含水影响分离，那硅胶、样品、溶剂都必须维持干燥，水分会严沉粉碎硅胶的吸附活性；反之若含水有利于分离，就不用过于控水。

3.确保选择的柱层析洗脱剂对样品拥有较好的溶化性，预防样品在洗脱过程中在柱内析晶。

4.在未齐全确定所有指标物之前，不要等闲抛弃任何接管瓶中的液体，不要处置硅胶柱，以防产品损失。

5.凭据分离的主张选择硅胶规格与洗脱剂的极性：分离难度大、黑点靠近选用细硅胶（200-300目），单一分离可用较粗硅胶（60-80目）以加快流快。

6.用完的溶剂桶实时盖好，存放在安全处。尽可能的节造柱层析过程中试剂挥发到操作环境，做到安全第一。

硅胶柱层析?合用分离中等极性至非极性的有机幼分子化合物，如大无数天然产品、生物碱、黄酮类、苷类、有机酸、甾体、芳香族化合物等天然活性成分以及难以通过结晶分离的合成中央体。硅胶柱层析作为分离纯化领域的经典技术，其精妙道理及严谨操作，共同铸就了高效精准的分离成效。

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